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技术创新丨诺唯赞Dimer Free技术突破NGS行业难题
发布时间：
2024-02-18
高通量测序文库构建时，你是不是也常常碰到这种情况：文库峰型图中目标文库前面出现非特异性片段，呈尖刺状，这就是二聚体，主要是由接头或引物自连所形成。
图1. 含二聚体的文库示意图
二聚体的存在会对实验结果造成较为严重的影响，一直是行业内亟待解决的难题。
二聚体的存在会导致以下问题：
1. 操作体验繁琐
在湿实验阶段需要针对不同投入量调整接头用量；
2. 影响数据质量
干扰文库真实产出的测定，导致有效下机数据量不足，数据质量差，难以满足后续分析需求；
3. 增加测序成本
严重时需加测数据量，造成时间和人力成本相应增加。
我们深深理解面对以上问题时的痛苦，因此，诺唯赞研发团队坚持不懈地研究，寻求创新的突破。经过无数次的试验和改进，最终开发出了Dimer Free技术（简称：DF技术），能够从根本上降低二聚体残留，提升数据质量，并统一接头用量，优化操作体验。为更准确和更便捷的建库实验保驾护航。
Dimer Free技术原理介绍
DF- Dimer Sniper消除原理
经研究发现，T4 DNA连接酶不仅可以对接头和模板进行连接（TA连接），同时也能够对其他不匹配的碱基进行连接（接头之间的TT连接）。在建库过程中形成的小片段二聚体，就是由于这种非特异性连接形成的错配产物，见下图2。
图2. T4 连接酶连接示意图
针对这一碱基错配特征，诺唯赞研发团队进行了深入研究和多次试验，最终从原核生物中发现了一种能够识别碱基错配的限制性内切酶，并以此为基础，通过蛋白质功能改造平台，运用理性设计和定向进化技术，进一步提升了该内切酶的识别特异性和切割活性，最终成功研发出一款高效的内切酶，命名为Dimer Sniper。该内切酶能够特异性地对T-T错配碱基进行切割，从而有效地消除接头二聚体。
图3. DF- Dimer Sniper消除原理
DF- Flowsizer筛选原理
除接头二聚体之外，在文库扩增过程中也会形成引物二聚体，这些二聚体的长度比正常文库偏小。基于这一特点以及对纯化过程的深入理解，诺唯赞研发团队开发出一款专门去除小片段的洗脱试剂，命名为Flowsizer。其原理类似于分子筛，可以根据片段大小的差异进行筛选，如下图4所示。在文库的回收过程中添加，可以特异性的对接头和引物二聚体进行去除，大幅提升目标文库比例。
图4. DF- Flowsizer筛选原理
测试数据展示
接头二聚清除效果测试：
对含有不同比例接头二聚体的文库进行测试，接头二聚体的去除效率均高达80%以上（最高可至100%）。
图5. 接头二聚体去除效果图
引物二聚清除效果测试：
在多重扩增建库中，文库纯化阶段使用DF技术可以显著降低引物二聚体的比例（高达90%以上），实现有效靶标的高效富集，提升测序的有效数据产出和靶标检出率。
图6. 引物二聚体去除效果图
统一稀释倍数，优化操作流程：
在以往的建库实验中，针对核酸投入量的不同，需要对接头进行不同比例的稀释，以减少二聚体的产生。现在，得益于DF技术的成功研发，可以真正做到“兼容”不同模板投入量，无需调整接头稀释比例，如图7所示。在提升操作体验的同时，也意味着在低模板投入量的场景下，可以通过增加接头用量来进一步提高文库转化率。
图7. 二聚体去除效果图
诺唯赞将对多系列产品统一引入二聚体清除技术，优化操作体验，全面改善测序结果，助力您的实验提质增效，敬请期待！
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