2 × Taq Plus Master Mix
高产高保真,让DNA扩增更成功
菌落PCR;高产量PCR;基因鉴定;
· 加入3’→5’外切酶活性
· 保真度是Taq DNA Polymerase的6倍
· 提高扩增产量和长度
· 即用型的预混液,较大程度地减少实验步骤
使用Taq Plus DNA Polymerase 分别扩增6 kb 和10 kb 的人基因组DNA 片段以及15 kb 的λDNA 片段。
M: DL15,000 DNA Marker
本产品适用于高产量PCR反应。相比于普通PCR,具有更高的保真度、更强的扩增性能和产量。只需加入引物和模板即可进行扩增,减少了移液操作,提高了检测通量和结果的重现性。体系中加入了保护剂,反复冻融后仍可保持稳定的活性。PCR产物的3'端带A,可直接克隆至T载体,并适用ClonExpress和拓扑克隆试剂盒(Vazyme #C112/C113/C115/C601)。
组分 |
P211-01 |
P211-02 |
P211-03 |
2 × Taq Plus Master Mix |
5 × 1 ml |
15 × 1 ml |
50 × 1 ml |
-20°C
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Q1:扩增效率低,实验组无扩增条带。
A1:(1) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解;引物设计是否合理,可利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(2) 模板
长期放置、反复冻融会导致模板断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的DNA双链作为模板;模板GC含量过高会导致DNA的双链无法打开,此时加入PCR Enhancer(货号P021),可以有效降低解链温度;模板的GC含量过低会导致扩增效率较差,可适当延长引物长度或通过梯度PCR摸索合适的反应条件;模板中存在抑制物,特别是甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,会造成DNA脱嘌呤而影响PCR结果,建议稀释使用或重新制备;若模板为cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度。
(3) 酶
反应所用的酶因保存或运输不当而失活,建议更换新酶或用另一来源的酶重新实验。
(4) 扩增体系
反应体系配制错误,建议重复实验。
(5) 反应程序
检查变性温度是否准确,PCR仪指示温度与实际温度是否相符。如果温度过高,酶在前几个循环就迅速失活;温度过低则模板变性不彻底。可对退火温度设置梯度,摸索合适的退火温度。检测延伸时间是否充足。
(6) Mg2+浓度不合适
Mg2+浓度过低可影响PCR产量甚至使PCR扩增失败;Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性,应适当调整Mg2+浓度。
Q2:扩增特异性差,非特异性扩增。
A2:(1) 引物
引物设计不够优化。引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体,可降低引物浓度进行优化,必要时重新设计引物。
(2) 模板
模板不纯,被污染,需重新制备模板。
模板降解或过量,通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新纯化模板。模板的使用量请参考说明书。
(3) 反应程序
反应程序不够优化。如果出现比目的条带小的杂带,可通过提高退火温度,降低循环数调整;如果出现比目的条带大的杂带,可缩短延伸时间、降低循环数。
(4) 酶
酶量加入过多。
Q3:扩增产物跑胶条带弥散或拖尾。
A3:(1) 胶
制胶时要使胶完全融化。
(2) 引物
检查人工合成的引物是否因存储条件不当而降解。
(3) 模板
模板降解或过量,可通过电泳检查模板完整性及浓度,必要时重新制备模板。模板的使用量请参考说明书。如果目的条带较长,模板是cDNA,要确认逆转录所用RNA的纯度及完整度,逆转录时不加随机引物重新逆转录。
(d) 反应程序
反应程序不够优化。退火温度不合适,可对退火温度设置梯度,摸索合适的退火温度;尝试Touch Down 程序。
(e) 酶
酶量加入过多。
Q4:空白对照出现扩增产物。
A4:(1) 引物设计不合理
扩增序列与非目的扩增序列有同源性,PCR也可以扩增出非靶序列的序列。
(2) 若扩增产物条带大小与目的条带一致,说明有污染
更换新的Mix、水或引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。
(3) 为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染,操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
(4) 为了避免靶基因受到空气中小片段核酸污染,可用巢式PCR方法减轻或消除污染。
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